Гиалуронан представляет собой гликозаминогликан, который образует во внеклеточном матриксе огромные комплексы с протеогликанами. Особенно в большом количестве эти комплексы присутствуют в хрящевой ткани, где гиалуронан посредством линкерного белка связывается с протеогликаном агреканом
Гиалуронан несет сильный отрицательный заряд и поэтому во внеклеточном пространстве связывается с катионами и с молекулами воды. Это приводит к увеличению жесткости внеклеточного матрикса и создает между клетками водяную подушку, которая гасит силы сжатия
Гиалуронан состоит из повторяющихся единиц дисахаридов, связанных в длинные цепи
В отличие от других гликозаминогликанов, гиалуронановые цепи синтезируются на цитозольной поверхности плазматической мембраны и затем выходят из клетки
Клетки связываются с гиалуронанами с участием семейства рецепторов, известных под названием гиаладгерины, которые инициируют сигнальные процессы, контролирующие миграцию клеток и сборку цитоскелета
Гиалуронан (ГК), также известный под названием гиалуроновая кислота или гиалуронат, представляет собой глюкозаминогликан (ГАГ). В отличие от других гликозаминогликанов (ГАГ), связанных с внеклеточном матриксом, гиалуронан не связан ковалентной связью с протеогликанами сердцевинных белков, а образует очень большие комплексы с секретируемыми протеогликанами.
К числу таких наиболее важных комплексов относятся комплексы, присутствующие в хрящевой ткани, где молекулы ГК , секретируемые хондроцитами (хрящеобразующие клетки), связываются примерно со 100 копиями протеоглика-на агрекана. Агрекановые сердцевинные белки через небольшой линкерный белок связываются с одной молекулой ГК через 40-нм интервалы. Такие комплексы в длину могут достигать более 4 мм и обладать мол массой, превышающей 2 х 108 дальтон. Таким образом, с участием ГК во внеклеточном матриксе хрящевой ткани создаются большие гидратированные пространства.
Эти пространства играют особенно важную роль в тканях с низкой плотностью кровеносных сосудов, поскольку они обеспечивают диффузию питательных компонентов и выведение продуктов обмена из внеклеточного пространства.
Гиалуроновая кислота (ГК) обладают очень простой структурой. Подобно всем ГАГ, они являются линейными полимерами одного из дисахаридов, глюкуроновой кислоты, связанной с N-ацетилглюкозамином посредством (3 (1-3) связи. Как показано на рисунке ниже, молекулы ГК содержат в среднем 10 000 (и до 50 000 этих дисахаридов, связанных b(1-4) связью. Поскольку дисахариды несут отрицательный заряд, они связывают катионы и молекулы воды.
Подобно протеогликанам , ГК увеличивают жесткость внеклеточного матрикса и служат в качестве смазки в таких соединительнотканных структурах, как . Гидратированные молекулы ГК также образуют между клетками водяную подушку, которая позволяет тканям гасить силы сжатия.
CD44 образует гомодимеры или гетеродимеры с рецепторами Erb2.Эти комплексы связываются с рядом сигнальных молекул,
которые контролируют организацию цитоскелета и экспрессию генов.
Молекулы гиалуроновой кислоты (ГК) гораздо крупнее, чем другие ГАГ. Из-за этого клетки должны расходовать на их формирование большие количества энергии. Подсчитано, что для формирования одной среднего размера цепи ГК, необходимо 50 000 эквивалентов АТФ, 20 000 кофакторов НАД и 10 000 групп ацетил-КоА. Поэтому в большинстве клеток синтез ГК находится под жестким контролем.
Синтез гиалуроновой кислоты (ГК) катализируется трансмембранными ферментами, ГК синтазами, локализованными в плазматической мембране. Эти ферменты несколько необычны в том смысле, что они собирают полимер ГК на цитозольной стороне плазматической мембраны, а затем переносят его через мембрану во внеклеточное пространство. Это принципиально отличается от синтеза других ГАГ, которые образуются в аппарате Гольджи и ковалентно связываются с протеогликанами сердцевинных белков по мере их прохождения по секреторному пути.
Важнейшим способом регуляции синтеза гиалуроновой кислоты (ГК) является изменение экспрессии ферментов, ГК синтаз. Экспрессия этих ферментов индуцируется специфичными для клеток факторами роста. Например, фактор роста фибробластов и интерлейкин-1 являются индукторами экспрессии ферментов в фибробластах, в то время как глюкокортикоиды подавляют экспрессию в этих же клетках. Эпидермальный фактор роста стимулирует экспрессию в кератиноцитах, но не в фибробластах. Секреция ГК контролируется независимо от их синтеза, и это обеспечивает, по крайней мере, два способа контроля уровня ГК в тканях.
Наряду с участием в гидратации тканей, гиалуроновая кислота (ГК) связывается со специфическими поверхностными рецепторами, что приводит к стимуляции внутриклеточных сигнальных путей, контролирующих такие процессы, как миграция клеток. Основным рецептором ГК является CD44, относящийся к семейству белков, называемых гиладгеринами, которые связываются с ГК. К остальным представителям этого семейства относятся протеогликаны (например, версикан, агрекан, бревикан) и линкерный белок, который связывает ГК с агреканом в хрящевой ткани. Множественные формы CD44 образуются при альтернативном сплайсинге транскриптов одного гена, хотя функциональные различия между этими изоформами остаются неясными.
CD44 существует в виде гомодимеров, которые экспрессируются во многих типах клеток или в виде гетеродимеров с ErbВ, тирозинкиназой, которая экспрессируется на эпителиальных клетках.
Цитоплазматический участок CD44 обладает несколькими функциями. Он необходим для правильного связывания с ГК и для сортинга рецепторов на клеточной поверхности. Он также участвует в процессах внутриклеточной передачи сигнала. Картирование функциональных областей в цитоплазматическом участке CD44 проводилось при изучении экспрессии мутантных форм CD44 в культуре клеток, и активации сигнальных путей после прикрепления клеток к ГК.
Из этих исследований мы знаем, что гомодимеры CD44 и гетеродимеры CD44/ErbB активируют нерецепторные тирозинкиназы, например Src, а также представителей семейства небольших G-белков, Ras. Эти киназы активируют такие сигнальные белки, как протеинкиназа С, МАР киназа и ядерные факторы транскрипции.
Наряду с этим, как показано на рисунке ниже, сигналы, передающиеся с участием CD44 , могут изменять сборку актинового цитоскелета у поверхности клеток. Это происходит при активации таких белков, связывающих актин, как фодрин и небольшого G-белка, Rac-1. Одним из последствий реорганизации актина является стимуляция миграции клеток под влиянием связывания CD44 с ГК. В опухолях усиление экспрессии CD44 и секреции ГК коррелирует с увеличением ее агрессивности, и является плохим прогностическим признаком.
Обычно считается, что гиалуроновая кислота (ГК ) играет двоякую роль в стимуляции миграции клеток. Во-первых, за счет связывания с внеклеточным матриксом ГК нарушает межклеточные взаимодействия и взаимодействие клеток с матриксом. Мыши, у которых не происходит экспрессии ГК, характеризуются незначительной величиной межклеточного пространства, вследствие чего животные не могут развиваться нормально. Поскольку ГК обладает большим гидратированным объемом, повышенная секреция ГК в опухоли нарушает целостность внеклеточного матрикса, что приводит к образованию больших промежутков, через которые могут мигрировать опухолевые клетки.
Во-вторых, при связывании ГК с рецепторами CD44 могут активироваться внутриклеточные процессы передачи сигналов, непосредственно приводящие к перегруппировкам цитоскелета и к активации миграции клеток. Это подтверждается данными, полученными в экспериментах по добавлению ГК к клеткам в культуре. Клетки, экспрессирующие CD44, начинают мигрировать сразу же после контакта с ГК, и соединения, разрушающие внутриклеточные сигнальные молекулы и связывающиеся с CD44, ингибируют эту миграцию.
Словосочетание «гиалуроновая кислота» не слышал, наверное, только мёртвый. За последние годы эта молекула просто захватила мир: «гиалуронку» (как её ласково называют поклонники) мажут, колют, глотают в таблетках и пьют в коктейлях – и всё ради молодости и красоты. Что же это за волшебное средство и правда ли, что мы, наконец, нашли молодильное яблочко? Давайте разбираться.
Что это такое?
Гиалуроновая кислота (ГК) – это не кислота в том значении, в котором мы обычно понимаем это слово: она не способна что-то растворить или отшелушить кожу (как, например, гликолевая или молочная). Это вещество естественным образом производится нашим организмом во множестве тканей, но больше всего в суставах.
В упрощенном понимании гиалуроновая кислота – это сахар, но с большой молекулярной массой, благодаря которой одна молекула ГК может притянуть и связать тысячу молекул воды. В нашем теле гиалуроновая кислота выполняет крайне важную задачу: сохранить воду в тканях. А увлажнённая кожа равно упругая кожа. Вот и всё волшебство.
Почему её используют в косметологии?
С возрастом в организме вырабатывается всё меньше и меньше гиалуроновой кислоты: в период с 25-ти до 50-ти лет её становится вдвое меньше. Ультрафиолет также снижает выработку «гиалуронки». Соответственно, вода уходит из кожи, из-за чего она становится вялой и морщинистой. Собственную ГК организм вырабатывать в прежних количествах не заставить, но зато можно ввести новую, искусственную порцию.
Как добывают гиалуроновую кислоту?
В прошлом веке ГК получали из рыбы или (страшно представить) из петушиных гребней. К счастью, этот варварский способ остался в прошлом, поскольку нашелся простой способ синтезировать гиалуроновую кислоту в лабораториях. В искусственном препарате нет бактерий, по составу он полностью идентичен «родной» кислоте, поэтому у него фактически нет противопоказаний.
Как работает крем с гиалуроновой кислотой?
На самом деле, это очень спорный момент – работают ли они вообще. Учёные и косметологи разделились на два лагеря: одни говорят, что размер молекулы ГК не позволяет ей проникать в кожу – и это действительно так. Диаметр молекулы гиалуроновой кислоты составляет около 3000 нм, в то время как расстояние между клетками кожи – не более 50 нм. Однако другие отвечают, что это вовсе и не нужно: находясь на поверхности кожи, гиалуроновая кислота уже, как губка, притягивает воду и тем самым увлажняет кожу.
Ещё один предмет для спора – низкомолекулярная ГК. Её создатели уверяют, что размер такой молекулы значительно уменьшен (до 5 нм), что позволяет веществу проникать в кожу и увлажнять её на глубоком уровне. По мнению других ученых, это абсурд, поскольку молекулы с малой молекулярной массой автоматически теряют способность удерживать на своей поверхности большое количество воды.
Точка в этих спорах пока не поставлена, поэтому вопрос, работают ли крема и сыворотки с гиалуроновой кислотой, остаётся открытым.
Как работают инъекции?
С помощью иглы врач-косметолог вводит препарат на основе гиалуроновой кислоты в проблемную зону (например, носогубную складку), и молекулы ГК начинают притягивать влагу с поверхности кожи в глубинные слои. Накапливаясь вокруг препарата, вода буквально выталкивает морщину изнутри. И лицо снова становится гладким и упругим.
Главный недостаток инъекций – это недолговременный эффект: процедуру нужно повторять каждые 6-12 месяцев. А вот стоимость препаратов и работы косметолога довольно высоки.
Как работают таблетки?
Скорее всего, совершенно никак. Гиалуроновая кислота – это простой полисахарид, который, попадая в ротовую полость и желудок, расщепляется на обыкновенные сахара, поэтому он никак не может попасть в кожу и оказать все те волшебные эффекты, которые обещают производители. Никакой научной базы, доказывающей эффективность БАДов с ГК у них нет, а выпускаются они по принципу «Не навредит – и то хорошо».
Изобретение относится к птицеперерабатывающей и фармацевтической промышленности, а именно к биохимическому способу получения гиалуроновой кислоты, применяемой в медицине в качестве ранозаживляющего средства и пролонгатора действия различных лекарственных средств, в парфюмерии и косметике. В способе получения гиалуроновой кислоты, включающем измельчение петушиных гребней, экстракцию, объединение экстрактов, отделение водной фазы, осаждение целевого продукта, перед измельчением сырье предварительно обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1: 2, затем измельченное сырье дополнительно подвергают обработке ультразвуком с частотой вибрации 16 - 20 кГц в течение 5 - 10 мин, а экстракцию проводят водой с температурой 45 - 50 o С в течение 20 - 25 мин, при этом отделение водной фазы осуществляют вакуумным фильтрованием, осаждение - 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 3 с последующим фильтрованием и сушкой препарата. Способ позволяет упростить технологический процесс получения гиалуроновой кислоты. 4 ил., 2 табл.
Изобретение относится к птицеперерабатывающей и фармацевтической промышленности, а именно к рациональному использованию сырьевых ресурсов и развитию нетрадиционных технологий на основе биохимического способа получения гиалуроновой кислоты (ГУК), применяемой в медицине в качестве ранозаживляющего средства и пролонгатора действия различных лекарственных средств, в парфюмерии и косметике. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения гиалуроновой кислоты, предусматривающий многократную экстракцию измельченных куриных гребней водным раствором н-пропилового, изо-пропилового или трет-бутилового спирта, объединение экстрактов, добавление к ним хлорида натрия, расслоение системы, отделение водной фазы и осаждение из него целевого продукта. Степень извлечения гиалуроновой кислоты 50%, содержание белка - менее 1)% . Недостатками способа является длительность процесса экстракции, значительный расход органического растворителя, токсичность производства, ограниченность применения. Технической задачей изобретения является упрощение технологического процесса, сокращение продолжительности экстракции, снижение уровня токсичности, ограниченное использование органического растворителя, полная его регенерация, повышающая экономическую эффективность производства, возможность размещать данное производство на птицеперерабатывающих предприятиях, решая проблему рационального использования сырья. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения гиалуроновой кислоты, включающем измельчение петушиных гребней, экстракцию, объединение экстрактов, отделение водной фазы, осаждение целевого продукта, новым является то, что перед измельчением сырье предварительно обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1:2, затем измельченное сырье дополнительно подвергают обработке ультразвуком с частотой вибрации 16-20 кГц в течение 5-10 мин, а экстракцию проводят водой с температурой 45- 50 o C в течение 20-25 мин, при этом отделение водной фазы осуществляют вакуумным фильтрованием, осаждение - 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:3 с последующим фильтрованием и сушкой препарата. Технический результат выражается не только в достижении поставленной задачи, но и в увеличении степени извлечения гиалуроновой кислоты, повышения качества целевого продукта, повышения экологичности производства, разработке и внедрении комплексной технологии, позволяющей использовать остаток животной ткани от выделения кислоты в производстве кормовой муки. Гиалуроновая кислота - типичный мукополисахарид. Важным структурным признаком его является наличие чередующихся остатков аминосахаров и остатков уроновых кислот. В тканях и жидкостях ГУК существует в свободном состоянии или ассоциирована с белками, образуя вязкие растворы. Биополимер входит до 5% к массе в состав основного вещества многих видов соединительной ткани (петушиные гребни, стекловидное тело глаза, синовиальная жидкость, кожа). В тканях петушиного гребня ГУК распределена в мукоидных волокнах подкожного слоя, наиболее широкого у основания . Гиалуроновая кислота - белое, твердое аморфное вещество, растворимое в воде и нерастворимое в органических растворителях. Характерным ее свойством является высокая вязкость. Молекулярная масса составляет от 510 4 - 810 6 , что зависит от происхождения препарата, способа и метода определения . По своей конформации молекулы ГУК представляют собой беспорядочно свернутые клубочки. Применение кислотного гидролиза, метилирования, использование нескольких видов ферментативного гидролиза гиалуронидазами различного происхождения и ряда других методов позволило предложить для гиалуроновой кислоты формулу, в которой чередуются остатки глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Эти дисахаридные фрагменты связаны в молекулы гиалуроновой кислоты - 1,4-связями (фиг.1) . Биологическое значение гиалуроновой кислоты состоит прежде всего в том, что она является цементирующим, как бы склеивающим веществом соединительнотканных систем организма. Она является основой функционирования муколитической системы, определяющей, в частности, проницаемость тканей и сосудов. Вследствие высокого значения молекулярной массы кислота выполняет роль структурообразователя, "связывателя" воды в промежуточных полостях, гелеобразных матрицах, что определяет тургор тканей и повышает их сопротивление действию сжимающих нагрузок. Способствует стойкости организма к проникновению инфекции. Антифрикционные и демпферные свойства тканевых жидкостей, в частности синовиальной, определяются наличием в них биополимера. Биологические свойства кислоты определили широкое ее использование при изготовлении лекарственных, фармацевтических препаратов и косметических изделий. Например, обоснована целесообразность использования ГУК как заменителя стекловидного тела. Использование ее растворов в качестве операционной среды, предохраняющей внутренние ткани глаза от механических воздействий, резко повышает эффективность операций на глазе человека. На основе гиалуроновой кислоты создаются вязкоэластичные материалы. Кроме офтальмологии, кислота используется в ревматологии (для замещения синовиальной жидкости), при лечении артрозов, в артопластике и остеомии для защиты хрящевых поверхностей и периферийного нерва, в дерматологии - для защиты кожных ран при экземах и трофических расстройствах кожи; в производстве косметических препаратов (гели, кремы, лосьоны). При определении общего химического состава коллагенсодержащего сырья пользовались методами: массовой доли влаги -; жира - методом Сокслета ; белка - . Фракционный состав белков определяли последовательным экстрагированием водо-, соле- и щелочерастворимых белковых фракций соответственно дистиллированной водой, раствором хлористого калия с массовой долей 5% и раствором гидроксида натрия с массовой долей 10% с последующим количественным определением белка с биуретовым реактивом . Традиционно в качестве объектов для получения гиалуроновой кислоты используют в основном пупочные канатики, синовиальную жидкость, стекловидное тело глаза, т.к. это сырье является наиболее доступным для специалистов, работающих в области медицины и фармакологии. Петушиные гребни также рекомендуется использовать в качестве источника ГУК . Проведенный нами сравнительный анализ химического состава гребня по отношению к другим коллагенсодержащим продуктам убоя птицы (фиг.2) показал преобладание в нем массовой доли белка (19,8% к массе сырья) при массовом превалировании протеиноидной фракции (14,4% к массе сырья). Проведение специфической гисто-морфологической окраски ткани по методу Ван-Гизона позволило выявить плотно упакованную систему коллагеновых волокон и пучков, определяющих упроченную структуру гребня. Высокая доля коллагеновых волокон в структуре ткани с низкой массовой долей жиров подтверждает целесообразность получения интересующего биополимера. В то же время следует подчеркнуть, что головы птицы с гребнем находят очень ограниченное применение в пищевых целях, а отдельно гребень не используется как исходное сырье совсем. Его выход составляет 3,8% к массе тушки. Таким образом, птицеперерабатывающая промышленность имеет реальные и достаточные резервы в получении биополимера за счет увеличения доли полезного использования вторичных малоценных продуктов переработки. Необходимым условием при производстве гиалуроновой кислоты является, прежде всего, возможность выделения ее в нативном высокополимеризованном состоянии, в виде высокоочищенных препаратов, свободных от белка. Способ получения гиалуроновой кислоты осуществляется следующим образом. Свежие петушиные гребни подвергались предварительной обработке в виде промывки проточной водопроводной водой и обескровливания этиловым спиртом в соотношении 1: 2. Отмытые от крови во избежание окислительной деструкции ткани могут быть "законсервированы" на длительное (до 24 мес.) время при температуре 4-22 o C в 95 %-ном этаноле . Для дальнейшей обработки гребни измельчали на гомогенизаторе (дезинтеграторе, шаровой мельнице) . С целью отделения белка и высвобождения кислоты из ее комплексов с белками и другими мукополисахаридами, подготовленные гребни подвергали ультразвуковой обработке с частотой вибрации 16-20 кГц в течение 5-10 мин и затем водной экстракции при температуре 45-50 o C в течение 20-25 мин. Водный раствор ГУК отделяли от остатка ткани путем вакуумного фильтрования. Из отфильтрованных растворов ГУК осаждали 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 3 и фильтровали. Осадок упаривали над пятиокисью фосфора в вакууме . Далее, в зависимости от назначения ГУК хранят в высушенном виде при температуре не выше -18 o C или растворяют в физиологическом буферном растворе и упаковывают в удобную тару, например в шприцы. Полученный таким способом биопрепарат представляет собой сплетение тончайших нитей большой жесткости. Он легко растворим в воде, давая совершенно прозрачные неопалесцирующие растворы. Промывку проточной водой сырья осуществляли с целью удаления механических примесей с поверхности гребней. Обескровливание проводили этиловым спиртом в соотношении 1:2, что способствует улучшению цвета и степени очистки готового биополимера. Использование более 2 объемов приводит к неоправданным расходам спирта, что экономически нецелесообразно, а менее - не давало желаемого эффекта. Любая процедура выделения ГУК включает последовательное разрушение структур на каждом уровне локализации с целенаправленным использованием при этом определенных факторов. Разрушение структур тканевого уровня достигается измельчением, гомогенизацией для обеспечения, прежде всего, максимального контакта с экстрагентами. Усиливает этот контакт предварительная обработка измельченных тканей гребня птицы ультразвуком, которую проводили с целью не только максимального извлечения биополимера, но и очистки его от белка и других примесей. Отмечено, что рациональной продолжительностью обработки является 5-10 мин. При меньшей продолжительности обработки недостаточен эффект отделения от белка (незначительная степень извлечения). Продолжительность обработки свыше 10 мин приводит к глубокой деструкции коллагеновых волокон и высоким потерям коллагеновой фракции, приводящих также к невозможности полной очистки от белковых примесей, что отражается на снижении качества готового препарата. Изучение влияния частоты вибрации предварительной обработки ультразвуком на эффективность очистки биополимера показывает, что наилучший эффект достигается в интервале 16-20 кГц. Частота менее 16 кГц недостаточна для глубокого и полного разрушения тканей, и, следовательно, снижает выход готового продукта, а выше 20 кГц затрудняет очистку и снижает качество препарата. В процессе водной экстракции значительное влияние на выход гиалуроновой кислоты оказывает температура (фиг.3). Отмечено, что при достижении температуры 50 o C наблюдается максимальный выход биополимера, причем дальнейшее увеличение температуры не приводит к существенным изменениям и создает условия для развития денатурационных и коагуляционных процессов, снижающих чистоту и качество препарата. А температура ниже 50 o C снижает скорость экстракции, и, следовательно, удлиняет весь технологический цикл. Гиалуроновую кислоту извлекают ив водной среды путем осаждения ее 95%-ным этиловым спиртом. Результаты проведенных исследований (фиг.4) показывают, что максимальный выход препарата наблюдается при соотношении водного раствора и спирта 1:3. Дальнейшее добавление объема спирта нецелесообразно, а объемы менее указанных не дают полного осаждения, и, следовательно, выхода продукта. Использование в технологии производства гиалуроновой кислоты спирта подразумевает полную его регенерацию. Согласно оценке химического состава осадок нерастворившихся тканей (массовая доля белка - 14,6%; жира - 5,6%) целесообразно использовать в производстве кормовой муки. Способ получения гиалуроновой кислоты поясняется конкретными примерами. Пример 1. Свежие петушиные гребни подвергают предварительной промывке проточной водопроводной водой и обескровливанию этиловым спиртом в соотношении 1:2. К 100 г измельченных на гомогенизаторе гребней добавляют воду в соотношении 1:3 и помещают в емкость генератора УЗ-колебаний и обрабатывают 5 мин при частоте вибрации 16 кГц. Затем смесь подвергают водной экстракции при температуре 45 o C в течение 20 мин. Экстракт отделяют от гребней вакуумным фильтрованием. Из водной среды гиалуроновую кислоту выделяют путем осаждения 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1:3. Отфильтрованный осадок упаривают над пятиокисью фосфора в вакууме. Гиалуроновую кислоту хранят в высушенном виде при температуре -18 o C. Данные по примерам 1-4 представлены в табл.1. Как видно из данных табл.1, способ получения гиалуроновой кислоты по режимам, приведенным в примерах 2, 16-20, приводит к получению биопрепарата, уступающего прототипу по качественным показателям, поэтому не является целесообразным с технологической точки зрения. Увеличение расхода спирта на обескровливание сырья и на осаждение кислоты (пример 15, 24) не приводит к снижению качественных показателей по сравнению с прототипом, однако нецелесообразно с экономической точки зрения. Способ получения ГУК по примерам 11-14, 16-23 приводит к недостаточной очистке препарата и снижению выхода. Способ получения гиалуроновой кислоты по режимам в примерах 1, 3-10 позволяет получить биополимер высокой степени очистки и выхода. Преимущества предлагаемого технического решения по сравнению с прототипом представлены в табл.2. Степень извлечения гиалуроновой кислоты по предлагаемому техническому решению выше (55%), чем в прототипе. Это обуславливает меньшие затраты в сырьевых источниках. Предлагаемый способ получения гиалуроновой кислоты значительно расширяет область применения технологии из-за нетоксичности производства. Позволяет максимально приблизить его к сырьевому источнику и комплексно перерабатывать сырье. Сокращается продолжительность экстракции. Экономическая эффективность возрастает в результате регенерации использованного спирта. Применение УЗ-обработки повышает выход препарата, что погашает затраты электроэнергии в предлагаемом способе. Полное исключение токсичных растворителей обеспечивает экологичность технологии и позволяет рационально использовать твердый остаток тканей после извлечения ГУК непосредственно на кормовые цели. Источники информации 1. Пат. 2017751 РФ, кл. C 08 B 37/08. Способ получения гиалуроновой кислоты / В.Ю.Ряшенцев, С.Ф.Никольский, Е.С.Вайнерман, В.И.Поляков, А.Н.Гуров, А.Н.Овчинников, Е.Ю.Игнатова /Россия/ - N 4939023/05: Заявлено 22.05.91; Опубл. 15.08.94, Бюл. N 15. 2. Lauert Т.C. // Chemistry and Molekular Biology of the Intercellutar Matrix / Ed. E.A.Balazs. - London, 1970. - P. 730. 3. Степаненко Б. H. Химия и биохимия углеводов /полисахариды/: Учебное пособие для вузов. - M.: Высшая школа, 1977. - 256 с. 4. ГОСТ 9793-74. Мясные продукты. Методы определения влаги. - Взамен ГОСТ 9793-61; Введ. 01.01.75. - M.: Изд-во стандартов, 1978. - 4 с. 5. Журавская Н.К., Алехина Л.Т., Отряшенкова Л.М. Исследование и контроль качества мяса и мясопродуктов. - М.: Агропромиздат, 1985. - 296 с. 6. ГОСТ 25011-81. Мясо и мясные продукты. Методы определения белка. - Введ. 01.01.83. - M.: Изд-во стандартов, 1982. - 10 с. 7. Практикум по биохимии животных / Е.С.Савронь, В.Н.Воронянский, Г.И. Киселев, Чечеткин, Н.Л.Докторович. - М.: Высшая школа, 1967. - 239 с. 8. Рябина B. P., Васюков C.E., Панов В.П., Стародубцев С.Г. Получение, свойства и применение гиалуроновой кислоты // Химико-фармацевтический журнал. - 1987. - N 2, с. 142-153. 9. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - 423 с. 10. Игнатова Е.Ю., Гуров А.Н. Принципы извлечения и очистки гиалуроновой кислоты (обзор) // Химико-фармацевтический журнал. - 1990. - N 3. - С. 42-46.
Формула изобретения
Способ получения гиалуроновой кислоты, включающий измельчение петушиных гребней, экстракцию, объединение экстрактов, отделение водной фазы, осаждение целевого продукта, отличающийся тем, что перед измельчением сырье предварительно обескровливают этиловым спиртом в соотношении 1: 2, затем измельченное сырье дополнительно подвергают обработке ультразвуком с частотой вибрации 16 - 20 кГц в течение 5 - 10 мин, а экстракцию проводят водой при температуре 45 - 50 o C в течение 20 - 25 мин, при этом отделение водной фазы осуществляют вакуумным фильтрованием, осаждение - 95%-ным этиловым спиртом в соотношении 1: 3 с последующим фильтрованием и сушкой.
Гиалуроновая кислота [ГК] найдена во внеклеточном матриксе позвоночных тканей, в поверхностном покрытии определенных видов Streptococcus и болезнетворных бактериальных микроорганизмов Pasteurella, а также на поверхности некоторых частично пораженных вирусом морских водорослей. Синтазы гиалуроновой кислоты [ГКС], это ферменты, которые полимеризуют ГК, используя UDP-сахарные предшественники, которые найдены во внешних мембранах этих организмов. Были идентифицированы гены ГКС из всех вышеупомянутых источников. Кажется, существуют два отличных класса ГКС, что основано на различиях в аминокислотной последовательности, предсказанной топологии в мембране и предполагаемом механизме реакции.
Все ГКС были определены как синтазы класса I, за исключением ГКС у вида Pasteurella. Был также объяснен каталитический способ работы единственной ГКС класса II (пмГКС). Этот фермент удлиняет внешние ГК-присоединяемые олигосахаридные акцепторы путем добавления индивидуальных моносахаридных единиц к неуменьшающемуся концу, чтобы сформировать длинные полимеры in vitro; ни одна ГКС класса I не имеет такой способности. Способ и направление полимеризации ГК, катализируемой ГКС класса I, остаются неясными. Фермент пмГКС также был проанализирован на предмет двух имеющихся у него активностей: GlcUA-трансферазной и GlcNAc-трансферазной. Таким образом, два активных участка существуют в одном пмГКС полипептиде, опровергая широко принятую догму гликобиологи: "один фермент - один модифицированный сахар". Предварительные свидетельства позволяют предполагать, что у ферментов класса I может также быть два участка активности.
Каталитический потенциал фермента пмГКС может использоваться, чтобы создать новые полисахариды или проектировать олигосахариды. Из-за множества потенциальных ГК-базирующихся медицинских методов лечения, эта хемоэнзиматическая технология обещает принести пользу на пути нашего стремления к хорошему здоровью.
Ключевые слова
Гиалуроновая кислота (ГК), хондроитин, гликозилтрансфераза, синтаза, катализ, механизм, химерные полисахариды, монодисперсные олигосахариды
Введение
Гиалуронан [ГК] - очень богатый глюкозаминогликан в организме позвоночных, имеющий и структурную, и сигнальную роли. Определенные патогенные бактерии, а именно, группы А и С вида Streptococcus и тип А Pasteurella multocida, производят внеклеточный покрывающий ГК, называемый капсулой. У обоих видов ГК капсула и является фактором ядовитости, который обеспечивает бактериям сопротивляемость фагоцитам и комплементарность. Другой организм, производящий ГК - это морская водоросля хлорелла, инфицированная определенным большим двухцепочечным ДНКовым вирусом PBCV-1. Роль ГК в жизненном цикле этого вируса пока не ясна на данный момент.
Иллюстрация 1. Реакция биосинтеза ГК.
Ферменты класса гликозилтрансфераз, которые полимеризируют ГК, называются ГК-синтазами (или ГКС), по старой терминологии, включающей также ГК-синтетазы. Все известные ГК-синтазы - это разновидности одного полипептида, ответственные за полимеризацию цепи ГК. UDP-сахарные предшественники, UDP-GlcNAc и UDP-GlcUA используются ГК-синтазами в присутствии двухвалентного катиона (Mn и/или Mg) при нейтральном pH (рис. 1). Все синтазы являются мембранносвязанными белками в живой клетке и обнаружены в мембранной фракции после лизиса клеток.
Между 1993 - 1998 были идентифицированы и клонированы на молекулярном уровне ГК-синтазы групп A и С Streptococcus [спГКС и сеГКС соответственно], ГК-синтазы позвоночных животных [ГКС 1,2,3], ГК-синтаза водорослевого вируса [свГКС], а также ГК-синтаза типа A вида Pasteurella multocida [пмГКС]. Первые три типа ГК-синтаз, кажется, очень похожи в размере, аминокислотной последовательности и предсказанной топологии в мембране. ГК-синтаза вида Pasteurella, напротив, больше и обладает существенно отличающейся от других синтаз последовательностью и предсказанной топологией. Поэтому, мы предположили существование двух классов ГК-синтаз (таблица 1). Ферменты класса I включают стрептококковые, позвоночные и вирусные белки, в то время как белок вида Pasteurella в настоящее время единственный член класса II. У нас также есть некоторые свидетельства того, что каталитические процессы ферментов класса I и класса II отличаются.
Таблица 1. Два класса ГК-синтаз:
Хотя ГК-синтаза вида Pasteurella был последним обнаруженным ферментом из всех, некоторые особенности пмГКС способствовали существенному продвижению в его изучении в сравнении с некоторыми членами ферментов класса I, которые исследовались четыре десятилетия. Ключевая особенностью пмГКС, которая позволила разъяснить молекулярное направление полимеризации и идентификацию ее двух активных участков - это способность пмГКС удлиннять внешне расположенный акцепторный олигосахарид. Рекомбинантная пмГКС добавляет одиночные моносахариды повторным способом к ГК-ассоциированному олигосахариду in vitro. Внутренняя особенность каждой передачи моносахарида ответственна для того, чтобы формировать альтернативное повторение дисахаридов в этом глюкозаминогликане; одновременное формирование дисахаридной единицы не требуется. С другой стороны, никакое подобное удлиннение внешних акцепторов не было доказано ни для какого фермента класса I. Через фундаментальное научное исследование мы теперь развили некоторые биотехнологические применения замечательного белка класса ГК-синтаз вида Pasteurella.
Материалы & методы
Реагенты
Все реактивы для молекулярнобиологических исследований без специальной пометки были от Promega. Стандартные олигонуклеотиды были от Great American Gene Company. Все другие реактивы высокой чистоты, если иначе не отмечено, были от Sigma или от Fisher.
Усечение пмГКС и точечные мутанты
Был произведен ряд усеченных полипептидов, путем амплификации pPm7А вставки методом полимеразной цепной реакцией с Taq-полимеразой (Fisher) и синтетическими олигонуклеотидными праймерами, соответствующими различным частям пмГКС, с открытой рамкой считывания. Ампликоны затем были клонированы в плазмиду для экспрессии pKK223-3 (tac промотор, Pharmacia). Получившимися рекомбинантными конструкциями были трансформированы клетки Escherichia coli штамма TOP 10F" (Invitrogen) и выращены на среде LB (Luria-Bertani) с ампициллиновой селекцией. Мутации были сделаны, используя метод QuickChange сайт-направленного мутагенеза (Stratagene) с плазмидой pKK/пмГКС как ДНК шаблон.
Приготовление фермента
Для приготовления мембраны, содержащей рекомбинантный пмГКС полной длины, пмГК1-972 был изолирован из E.coli, как описано. Для растворимых усеченных пмГКС белков, пмГКС1-703, пмГКС1-650 и пмГКС1-703 - содержащих мутантов, клетки были извлечены с помощью В-PerТМ II Bacterial Protein Extraction Reagent (Pieree) согласно инструкции производителя, за исключением того, что процедура была выполнена при 7°C в присутствии ингибиторов протеаз.
Ферментные пути полимеризации ГК. GlcNAc модификация или GlcUA модификация
Три варианта было разработано, чтобы обнаружить происходит ли (а) полимеризация длинных цепей ГК или (b) добавление одиночного GlcNAc к GlcUA-конечному акцепторному олигосахариду ГК , или (c) добавление одиночного GlcUA к GlcNAc-конечному акцепторному олигосахариду ГК . Полная активность ГКС была оценена для раствора, содержащего 50 mM Tris, pH 7.2, 20 mM MnCl2, 0.1 M (NH4)2SO4, 1 M этиленгликоля, 0.12 mM UDP-(14C)GlcUA (0.01 μCi; NEN), 0.3 mM UDP-GlcNAc и различный набор ГК олигосахаридов, полученный из тестикул путем обработки гиалуронидазой [(GlcNAc-GlcUA)n, n= 4-10] при 30°C в течение 25 минут в объеме реакционной смеси 50 мкл. GlcNAc-трансферазная активность была оценена в течение 4 минут в той же буферной системе с различным набором ГК олигосахаридов, но только с одним сахаром в роли предшественника - 0.3 mM UDP-(3H)GlcUA (0.2 μCi; NEN). GlcUA-трансферазная активность была оценена в течение 4 минут в той же самой буферной системе, но только с 0.12 mM UDP-(14C)GlcUA (0.02 μCi) и с нечетным набором ГК олигосахаридов (3.5 мкг уроновой кислоты), приготовленных при помощи воздействия ацетата ртути на ГК-лиазу Streptomyces. Реакции были прекращены путем добавления SDS до 2% (w/v). Продукты реакции были отделены от субстратов путем бумажной (Whatman 3M) хроматографии с этанолом/1 М сульфат аммония, pH 5 5, как основной растворитель (65:35 для ГКС и оценки GlcUA-Tase; 75:25 для оценки GlcNAc-Tase). Для оценки ГКС образец бумажной полосы был промыт водой, и объединение радиоактивных сахаров в полимер ГК было обнаружено по сцинтилляции жидкости, рассчитанной при помощи BioSafe II коктейля (RPI). Для реакций полуиспытания образец и расположенные вниз по течению 6 см полосы были посчитаны по частям в 2 см. Все оценочные эксперименты были просчитаны таким образом, чтобы быть линейными относительно времени инкубации и концентрации белка.
Гель-фильтрационная хроматография
Размер ГК полимеров был проанализирован хроматографически на колонках Phenomenex PolySep-GFC-P 3000, элюция производилась 0.2 M нитратом натрия. Колонка была стандартизована флуоресцентными декстранами различного размера. Радиоактивные компоненты были обнаружены с помощью датчика LB508 Radioflow (EG & G Berthold) и коктейля Zinsser. По сравнению с полной оценкой ГКС, используя бумажную хроматографию, описанную выше, эти 3-минутные реакции содержали дважды UDP-сахарные концентрации, 0.06 μCi UDP-(14C)GlcUA и 0.25 нанограмма ряда ГК олигосахаридов. Кроме того, использовалось добавление кипящего (2 минуты) этилендиамина тетрациловой кислоты (финальная концентрация 22 mM), чтобы закончить реакции вместо добавления SDS.
Результаты и обсуждение
Утилизация и специфичность акцептора ГКС
Некоторые олигосахариды были проверены, в качестве акцепторов для рекомбинантного пмГКС1-972(Таблица 2). ГК олигосахариды были получены из тестикул путем гиалуронидазного щепления, а удлиннены пмГКС с помощью доставляемых подходящих UDP-сахаров. Восстановление борогидратом натрия не нарушает активность акцептора. С другой стороны, олигосахариды, полученные из ГК при помощи отщепления лиазой, не поддерживают удлиннение; дегидратированные ненасыщенные невосстановленные концевые остатки GlcUA нуждаются в гидроксильных группах, которые смогли бы присоединить входящий сахар из UDP-предшественника. Поэтому пмГКС-катализируемое удлиннение происходит в случае невосстановленных концевых групп. В ряде параллельных экспериментов было обнаружены рекомбинантные формы синтаз класса I - спГКС и х1ГКС, которые не удлинняют ГК-получаемые акцепторы. Принимая во внимание направление активности ферментов класса I, противоречивые сообщения были сделаны и необходимы дальнейшие исследования.
Таблица 2. Специфика олигосахаридных акцепторо пмГКС:
Интересно, что хондроитин сульфат пентамер является хорошим акцептором для пмГКС. Другие структурно связанные олигосахариды такие, как хитотетроза или хепарозан пентамер, однако, не служат акцепторами для пмГКС. В целом, пмГКС, кажется, требует, β-связанных GlcUA-содержащих акцепторных олигосахаридов. Мы выдвигаем гипотезу, что участок связывания олигосахаридов промежуточен в цепи удерживания ГК во время полимеризации.
Молекулярный анализ активности пмГКС трансферазы: два активных участка в одном полипептиде
Возможность измерить два компонента гликозилтрансферазной активности ГК синтазы, GlcNAc-трансфераза и GlcUA-трансфераза, позволил молекулярный анализ пмГКС. Мы отметили, что короткий дублированный мотив последовательности: Asp-Gly-Ser (Аспарагиновая к-та-Глицин-Серин), присутствовал в пмГКС. Из анализа сравнения гидрофобных групп многих других гликозилтрансфераз, которые производят β-связанные полисахариды или олигосахариды предположили, что вообще, существует два типа доменов: области "A" и "Б". ПмГКС, синтаза класса II, тем и уникальна, что содержит два "А" домена (личная коммуникация, B.Henrissat). Было предложено, что определенные члены класса I ГК синтаз (спГКС) содержат одиночные "А" и одиночные "Б" области. Различное удаление или точечные мутанты пмГКС были оценены для их способности полимеризовать ГК цепи или их способность добавлять одиночный сахар к ГК акцепторному олигосахариду (Таблица 3). Суммируя сказанное, пмГКС содержит два отличных друг от друга активных участка. Мутагенез аспартата мотива DGS (остаток 196 или 477) по обоим сайтам приводи к потере ГК полимеризации, но активность другого сайта оставалась относительно незатронутой. Таким образом, двойная активность ГК синтазы была преобразована в два различных одиночных действия гликозилтрансферазы.
Таблица 3. Активность пмГКС с удаленным участком или точечной мутацией.
Удаление последних 269 остатков от конечной карбоксильной группы преобразовало слабо выраженный мембранный белок в хорошо выраженный растворимый. Рассмотрение аминокислотной последовательности белка пмГКС в этой области, однако, не показывает типичных особенностей вторичной структуры, которые обеспечили бы прямое взаимодействие фермента с двойным слоем липида. Мы выдвигаем гипотезу, что конечная карбоксильная группа каталитического фермента пмГКС стыкуется с направляющим мембраносвязанным полисахарида транспортного аппарата живущей бактериальной клетки.
Первая "A" область пмГКС, А1, является GlcNAc-тазой, в то время как вторая "A" область, A2, является GlcUA-тазой (рис. 2). Это - первая идентификация двух активных участков для фермента, который производит гетерополисахарид, так же как ясное доказательство, что один фермент может действительно передать два различных сахара. Отличный от типа F фермент вида P. multocida, названный пмЦС, был найден, и вяснено, что он катализирует формирование несульфатируемого полимера хондроитина. ГК и хондроитин идентичны в структуре, за исключением упомянутого выше полимера, который содержит N-ацетилглюкозамин вместо GlcNAc. И пмГКС, и пмЦС на 87 % идентичны на уровне аминокислот. Большинство изменений в остатках находятся в области А1, что вполне совместимо с гипотезой о том, что эта область ответственна за передачу гексозамина.
Иллюстрация 2. Схематическое изображение пмГКС областей.
Два независимых трансферазных домена, А1 и A2, ответственны за катализ полимеризации цепи ГК. Повторяющиеся последовательные добавления одиночных сахаров быстро строят цепь ГК. Похоже, что карбоксильный конец пмГКС некоторым способом взаимодействует с мембранносвязанным транспортным аппаратом бактериальной клетки.
Иллюстрация 3. Модель биосинтеза ГК при помощи пмГКС.
Одиночные сахара добавляются к каждому "A" домену повторным способом к невосстанавливающемуся концу цепи ГК. Внутренняя точность каждой стадии активности трансферазы поддерживает повторение структуры дисахаридов ГК. Возникающая цепь ГК вероятно сохраняется пмГКС во время катализа через олигосахарид-связывающий участок.
Мы продемонстрировали эффективную передачу одиночного сахара с помощью пмГКС in vitro несколькими типами экспериментов, поэтому, мы выдвинули гипотезу, что цепи ГК формируются быстрым, повторяющимся добавлением одиночного сахара синтазой класса II (рис. 3). К настоящему времени, одна линия свидетельства предполагает, что фермент класса I также обладает двумя участками трансферазы. Мутация лейцинового остатка 314 на валин в ммГКС1, в части предварительного участка GlcUA-тазы, как сообщали, преобразовала эту ГКС позвоночного животного в хито-олигосахаридную синтазу. Ни один участок с соответствующей активностью GlcNAc-трансферазы не был идентифицирован.
Прививание полимера полисахаридными синтазами: добавление ГК к молекулам или твердым частицам
Исследование пмГКС в научно-исследовательской лаборатории преобразовало представления о ГК синтазах от царства трудных, упорных животноподобных чудовищ до потенциальных биотехнологических рабочих лошадок. Новые молекулы могут быть сформированы, используя способность пмГКС привить длинные цепи ГК на коротких ГК полученных цепях или хондроитин-производных акцепторах. Например, полезные акцепторы могут состоять из маленьких молекул или лекарств с ковалентно связанной ГК или хондроитин-олигосахаридные цепи (длиной в 4 сахара, например). В другом случае, цепи ГК могут быть добавлены к олигосахаридному праймеру, иммобилизованному на твердой поверхности (таблица 4). Таким образом, длинные цепи ГК могут быть мягко добавлены к чувствительным веществам или тонким устройствам.
В другом приложении, новые химерные полисахариды могут быть сформированы потому, что использование пмГКС олигосахаридным акцептором не столь же строго, как сахаридная трансферазная специфика. Хондроитин и хондроитин-сульфат признаны как акцепторы пмГКС и удлинняются ГК цепью различных длин (рис. 4). Наоборот, пмЦС очень гомлогичная хондроитин синтазе, распознает и удлинняет ГК акцепторы цепями хондроитина. Химерные молекулы глюкозаминогликана сформированы, содержа естественные, определенного соединения связи. Эти привитые полисахариды могут служить, чтобы присоединиться к клетке или ткани, которая связывает ГК с другой клеткой или ткань, связывающей хондроитин или хондроитин-сульфат. В определенных аспектах, привитые глюкозаминогликаны напоминают протеогликаны, которые являются существенными компонентами матрикса в тканях позвоночных. Но так как никакие компоновщики белка не присутствуют в химерных полимерах, то антигенность и проблемы протеолизиса, возникающие вокруг медицинского использования протеогликанов, устранены. Риск передачи инфекционных агентов тканями, извлеченными из животных, человеческому пациенту также уменьшен при использовании химерных полимеров.
Таблица 4. ПмГКС-инициированное прививание ГК на бусинки полиакриламида. Реакционная смесь содержит пмГКС, несущий радиоактивную метку UDP-(14C)GlcUA и UDP-(3H)GlcNAc, а также различные иммобилизованные праймеры сахаров (акцепторы, соединенные восстановительным аминированием в аминобусины) были представлены. Бусинки были промыты и радиоактивно инкорпорированы на другие бусины, измеренные методом расчета жидкостной сцинтилляции. ГК цепи были привиты на пластиковые бусины при использовании подходящего праймера и пмГКС.
Иллюстрация 4. Схематическое изображение привитых полисахаридных структур. ГК синтаза вида Pasteurella или хондроитин синтаза будут удлиннять определенные другие полимеры на невосстанавливающемся конце in vitro, чтобы сформировать новые химерные глюкозаминогликаны. Изображены некоторые примеры.
Синтез монодисперсной ГК и ГК-связанных олигосахаридов
В дополнение к добавлению большой полимерной ГК цепи к молекулам акцептора, пмГКС синтезируют определенные меньшие ГК олигосахариды в диапазоне от 5 до 24 сахаров. Используя фермент дикого типа и различные условия реакции, был относительно легко получен ГК олигосахарид, содержащий 4 или 5 моноахаридов, удлиненных несколькими сахарами до более длинных версий, которые очень часто трудно получить в больших количествах. Мы выяснили, что, комбинируя растворимый мутант GlcUA-Tase и растворимый мутант GlcNAc-Tase в той же самой смеси реакции позволяет формирование ГК полимера, если система снабжена акцептором. В течение 3-х минут была сделана цепь из примерно 150 сахаров (-30 кДа). Любая одиночная мутант-синтаза не сформирует в результате цепь ГК. Поэтому, если дальнейший контроль реакции сделан путем выборочного комбинирования различных ферментов, UDP-сахаров и акцепторов, то могут быть получены определенные монодисперсные олигосахариды (рис. 5).
Иллюстрация 5. Приготовление определенных олигосахаридов.
В этом примере, акцептор ГК тетрасахарид удлинняется одиночной хондроитин дисахаридной единицей, используя два шага с иммобилизованным мутантом синтазы вида Pasteurella (показано белыми стрелками). Изображенный продукт является новым гексасахаридом. Повторение цикла еще раз производит олигосахарид, два цикла формируют декасахарид, и т.д. Если акцептор был ранее соединен с другой молекулой (например препарат или лекарство), тогда новый конъюгат был бы удлиннен коротким ГК, хондроитином или гибридной цепью как и желательно.
Например, в одном воплощении, смесь UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA и акцептора постоянно циркулирует через отдельные биореакторы с иммобилизованными мутант-синтазами, которые передают только одиночный сахар. С каждым циклом инкубации биореактора другая сахарная группа добавляется к акцептору, чтобы сформировать маленькие определенные ГК олигосахариды. Использование похожего пмЦС мутанта (например GalNAc-Tase) в одном из шагов позволило происходить формированию смешанных олигосахаридов при использовании UDP-GlcNAc. Биологическая активность и терапевтический потенциал маленьких ГК олигосахаридов - сложная область для исследования, которая потребует определенных, монодисперсных сахаров для однозначной интерпретации.
Заключение
Очевидно, существуют два различных класса ГК синтаз. Наиболее хорошо охарактеризован фермент класса II вида Рasteurella, удлинняющий цепь ГК повторяющимся присоединением одиночного сахара на невосстанавливающийся конец цепи ГК. Направление и способ работы синтаз класса I (стрептококковые, вирусные и ферменты позвоночных) остаются неясными. Относительно прикладных наук, способность пмГКС удлиннять экзогенно расположенные акцепторные молекулы полезна для создания новых молекул и/или устройств с потенциальным медицинским применением.
Гиалуроновая кислота (ГК), также известная как (соль кислоты) или гиалуронан (объединяющее обозначение для кислоты и ее соли), представляет собой анионный натуральный полисахарид (несульфированный простейший гликозаминогликан), который является важным компонентом нервной, эпителиальной, соединительной тканей и основным ингредиентом внеклеточного матрикса.
Гиалуроновая кислота также входит в состав многих, присущих живым организмам биологических жидкостей (синовиальная жидкость, слюна и пр.). Данное вещество может продуцироваться некоторыми бактериями (например, стрептококками ) и выделяться из органов животных (гребень петуха, стекловидное тело и хрящевая ткань рогатого скота).
В человеческом теле массой около 70-ти килограмм в среднем содержится примерно 15 граммов этой эндогенной кислоты, третья часть которой ежесуточно подвергается преобразованию (расщепляется или синтезируется).
Структура и строение
Структурная схема ГК характерна для линейного полисахарида, состоящего из чередующихся остаточных частей N-aцетил-D-гликозамина и D-глюкуроновой кислоты , последовательно соединенных гликозидными связями β-1,3 и β-1,4.
Одна молекула данной кислоты может включать до 25 тысяч подобных дисахаридных звеньев. ГК природного происхождения обладает молекулярной массой варьирующей в пределах 5000-20000000 Да. У человека среднее значение молекулярной массы находящегося в синовиальной жидкости полимера равняется 3140000 Да.
Молекула кислоты энергетически стабильна, в том числе вследствие стереохимии дисахаридов входящих в ее состав. В пиранозном кольце объемные заместители расположены в стерически выгодных позициях, тогда как меньшие по объему атомы водорода размещены в менее выигрышных аксиальных положениях.
Образование: Окончил Винницкий национальный медицинский университет им. Н.И.Пирогова, фармацевтический факультет, высшее фармацевтическое образование – специальность «Провизор».
Опыт работы: Работа в аптечных сетях «Конекс» и «Биос-Медиа» по специальности «Фармацевт». Работа по специальности «Провизор» в аптечной сети «Авиценна» города Винница.
Комментарии
Я тоже кстати гиалуронку в таблетка принимаю. Кстати, у Эвалара хорошая, да, но там эффект накопительный, надо 2 месяца пить и не забывать
Было много проблем с кожей:шелушилась, трескалась, стали появляться морщины. Из-за этого решила попробовать гиалуроновую кислоту в таблетках, да так и осталась ее пить. Уже 6 курсов прошла, с кожей стало гораздо лучше, даже холода теперь не страшны.
Спасибо за хорошую статью. Сама принимаю гиалуронку уже давно. Пробовала и крем, и инъекции, но остановилась на таблетках. Думаю, что это все-таки самое практичное, что создали.